Őssejtektől tanulták el az mRNS-terápia hasznos fehérjéit – interjú Prof. Dr. Nógrádi Antal idegkutatóval

– Professzor úr, az ön csoportja a gerincvelő-sérülések kutatásában őssejtbeültetéssel ért el eredményeket az elmúlt években; rágcsáló modellben tisztázták például az őssejtek által termelt fehérjék hatásmechanizmusát. Az őssejtes kezelés sikeres kutatási irányuk volt, miért kezdtek el mRNS-terápiával foglalkozni?

– A 2000-es években a sérült motoneuronok megmentésével kezdtünk foglalkozni. Vannak állapotok, amikor ezek a mozgatóidegsejtek gerincvelői betegségek vagy sérülések következtében elpusztulnak, de még megmenthetők, ha az akut fázisban beavatkozunk. Ennek egyik lehetőségeként indítottuk el 2007-ben őssejtterápiás kísérleteinket, Duda Ernő professzor segítségével. Az ő fagyasztójában lapult egy jó minőségű egér őssejtvonal, amit annak idején még Madarász Emília professzor asszonnyal izoláltak. Sajnos az elérhető őssejtek jelentős része nem használható beültetésre, de amikor kiderült, hogy a mi sejtvonalunk valóban használható károsodott idegsejtek megmentésére, nekifogtunk kideríteni, hogyan is működik. Sokan propagálták azt a lehetőséget, hogy a beültetett őssejtek differenciálódással, átalakulással az elpusztult sejtek helyére lépnek, vagyis sejtpótlás történhet. Ennek nagyon csekély jeleit láttuk, csupán új velőshüvelyképző sejtekből találtunk párat, amelyek ebből a sejtvonalból indultak ki. Feltűnt viszont egy úgynevezett humorális, vagyis a sejtek által termelt molekulákhoz kötött mechanizmus, amelynek során az őssejtek a sérülés környékére beültetve egy 4-5 faktorból álló ún. „szekretomot” termeltek; ezt mi „sérülés által kiváltott szekretomnak” neveztük el. Amikor már ismertük a szekretom összetételét, úgy döntöttük, hogy ejtjük az egész őssejtbeültetési irányt. Elvégre senki sem szeretne egér őssejtet, vagy annak módosított változatait kapni. Inkább tanuljuk el az őssejtektől a tapasztalt humorális mechanizmust, és alapozzuk erre a kutatást! A következő időszakban kiderült, hogy ez működik, reprodukálni tudjuk az eredményeket csupán azzal, hogy önállóan, őssejtek nélkül bejuttatjuk a termelt szekretomot. A bejuttatás viszont már bonyolultabb feladat volt. Ekkor jött az ötlet, hogy mRNS-technológiával is meg tudnánk valósítani. A terv az volt, hogy olyan módosított mRNS-t juttatunk be a sérüléshez, ami a szekretom faktorait kódolja. Ezért 2019-ben felvettük a kapcsolatot Pardi Norberttel a Pennsylvaniai Egyetemről, aki Karikó Katalin és Drew Weissman kutatásai nyomán foglalkozott az mRNS-technológiával.

– A járvány előtt még egyáltalán nem volt a tudományos figyelem központjában az mRNS-alapú terápia. Önök mit tudtak róla?

– Egyikünk sem hallott még akkor az idegrendszeri mRNS-terápia részleteiről. Tudtuk, persze, hogy mi is az mRNS, tudtuk, hogy folynak kutatások a terápiás felhasználására, de semmit nem tudtunk arról, hogy a gerincvelő-sérülés környezetében hogyan fog ez működni. A csupasz mRNS ugyan működhet, ha betuszkoljuk a sejtbe, de oda nehéz bevinni. Úgy gondoltuk, sejtkultúrában még működhet, de egy in vivo kísérletben, élő állatban már minden másképp van. Amikor azonban Pardi Norberttel felvettük a kapcsolatot, az mRNS szállítására szolgáló lipid nanorészecskéket már jól működő technológiaként alkalmazták. Megjegyzem, a lipidburokba csomagolás hatékonyságáról Pardi Norbertnek másfél évig tartott meggyőznie a kanadai Acuitas biotechnológiai céget; szóval, ott sem megy egyből minden. Az első mRNS-csomaggal először is megnéztük, hogy egy zöld fluoreszkálást kiváltó egyszerű jelzőfehérje, a GFP hogyan jut célba: a sejtek felveszik a fehérjét kódoló mRNS-t, majd expresszálják, és megbizonyosodtunk arról, hogy ez intakt és sérült állatokban is megtörténik. Ezután tértünk rá egy terápiás fehérje, az IL-10 bejuttatására. Az IL-10 egyike volt azoknak a faktoroknak, amelyeket a szekretomban megtaláltunk. Gyulladáscsökkentő fehérje, önmagában is hatása van, ezért döntöttünk úgy, hogy önálló kísérletekben feltárjuk az IL-10 mRNS hatását. Mivel a neuronok hordozzák az IL-10 fehérje receptorát, valószínűsítettük, hogy a kész fehérje kötődni tud az idegsejtekhez. A kezelt állatok eredményeit összehasonlítva kiderült, hogy a szekretomban kimutatott 4 fehérje összhatásának 60 százaléka az IL-10 fehérjének volt köszönhető. Tudtuk tehát, hogy az IL-10 idegsejteket védő és gyulladáscsökkentő jellegű, de nekünk egy olyan fehérjére is szükségünk volt, ami a túlélő és sérült idegsejtek axonjait, idegsejt-nyúlványait támogatja a növekedésben. Ez volt a GDNF, amit úgyszintén tartalmazott a szekretomunk.

Karikó Katalin és Nógrádi Antal a konferencia szünetében

– Zavarba ejtő, hogy az őssejt ennyire célirányosan hasznos anyagokat választ ki egy másik egyed sérülésére! Gondolkodott azon, hogy vajon miért?

– Nem tudjuk ugyan jól megfogalmazni, hogy miért, de az nyilvánvaló, hogy az őssejtek intelligens módon tették a dolgukat, képesek voltak egy jó szekretomot összeállítani a sérülés környezetében. Gondoljunk bele, nem arról van szó, mint sok más esetben, hogy az őssejt gyárt egy szekretomot alapállapotban is, majd ezt megváltoztathatatlanul viszi tovább a sérülésnél, és nem hajlandó változtatni ezen a felálláson! Hanem éppen az történik, hogy ezek az őssejtek natív állapotban, sejttenyészetben nem termelnek számunkra hasznos anyagokat. Viszont amint bekerülnek egy sérült környezetbe, alkalmazkodnak a sérülés típusához, és különféle interakciók révén a sérülés számára legkedvezőbb szekretom összeállítást kezdik el termelni, egészen addig, amíg az őssejt el nem kezd átalakulni, differenciálódni. Ahogy a differenciálódás elindul, a fehérjék termelése is lezárul. Hozzáteszem, hogy a kutatásunk szempontjából ez nem okozott problémát, mert nekünk éppen a szekretom fehérjéi által biztosított terápiás ablakra van szükségünk.

– A konferencián tartott előadásában – mint laikust – meglepett, hogy egy második gyulladási hullám is bekövetkezik a gerincvelő sérülésénél.

– Sőt, több hullám is megjelenik! Először is a sérülés miatt egy erős első hullámban beáramlanak az idegen elemeket eltakarító makrofág falósejtek. Napokkal később következik be a második hullám, ami egy másfajta gyulladásos mechanizmust vált ki. Ott is érkeznek makrofág sejtek, de a gerincvelő-sérülésnél inkább azt látjuk, hogy a sérülés által kiváltott üreg növekedését a megsérült sejtek pusztulása eredményezi. A pusztulófélben lévő sejtek ebben a fázisban még megmenthetők lehetnek. A fizikai sérülés eredménye már nem hozható helyre, de a második gyulladási hullám előtt még be lehet avatkozni, hogy a sérülés ürege ne növekedjen tovább. Ami a további hullámokat illeti, leírták, hogy meglepő módon még több héttel később, több hullámban is érkeznek makrofágok a gerincvelőbe, holott addigra már az egész sérülés átmegy egy szubakut, majd egy krónikus fázisba. Az újabb makrofág hullámok jelentőségét egyelőre nem látja senki. Feltételezzük, hogy valójában arra szolgálnak, hogy amíg kialakul a gyulladás utáni heges, rögzült kép, ezt tisztítják le a makrofágok.

– Az időablak az első két hullám között van, ha jól értettem.

– Igen, a kettő között, körülbelül a 6-7. naptól nyílik meg. Akkora cseng le a falósejtek első hulláma. A beáramlási csúcs a negyedik napon van, majd csökkenni kezd. Van egy pont, amikor az üreg már kezd kitisztulni, a második fázis még nem indult el, de az első lassan lecseng, ekkor lehet egy sejtterápiás időablakot nyitni. Természetesen van egy azonnali kezelési lehetőség is, ami a sérülés legelején nyílik meg. Ha ekkor kívülről bejuttatunk egy hatékony molekulát, az már ott bejuthat, hiszen a vér-agy gát már akkor sérült, nyitva van.

– Úgy kell elképzelnünk, hogy a sérült gerincvelőbe befecskendezik a lipid-nanorészecskékbe csomagolt mRNS-t?

– Ez volt az első megközelítésünk. A LNP-be csomagolt módosított mRNS-t be is lehet fecskendezni. Az RNS maga eléggé kicsiny anyag, de amikor már becsomagoljuk, többszörös méretűre nő. Ez mennyiségi korlátot is jelent. Említettem, hogy a 7. napra kialakul egy üregkezdemény a gerincvelőben a sérülés helyén. Ez a zúzódásos üreg kicsiny, mindössze pár mikroliternyi térfogatú, egy csepp méreténél is kisebb. Oda csak annyi anyagot szabad betenni, ami nem okoz nagyobb károsodást, és nem tágítja ki az üreget. Csakhogy, a sérült gerincvelőt föltárni, oda valamit befecskendezni egy másik trauma, amit egy éppen lezajló elsődleges gyulladási fázis végén nem a legszerencsésebb megtenni. Amikor a szekrétumnak mind a négy faktorát akartuk bejuttatni, látszott, hogy ez már a határt feszegeti. Gondolkozni kezdtünk tehát, hogy milyen alternatív utak vannak. Az irodalomban szinte ismeretlen az a tény, hogy a szervezet egyes részein falósejt tartalékok vannak. Nagyon piciny sejtek várnak nyugton a hashártyára letapadva, hogy mikor induljanak el rendet tenni egy gyulladásos pont felé. Az első tapasztalataink szerint, ha ebbe a zárt térbe juttatunk be mRNS-t, akkor két út áll előtte: elmegy a szisztémás keringésbe és azután a máj felé veszi az irányt, vagy pedig a falósejtek azonnal fölveszik az mRNS-t és a mi tapasztalataink szerint órákon belül átalakítják jelentős mennyiségű fehérjévé. Eközben a sejt elindul az útján, mert megkapja azt az üzenetet, hogy a gerincvelő-sérüléshez kell mennie, mert ott van a baj – és viszi magával a terápiás fehérjéket. Ez az alkalmazási útvonal elképzelhető emberben is.

– Az mRNS-konferencia közönsége is elismerően fogadta ezt a terápiás felhasználást! Van még hasonló ötletük?

– Rutinban, például a kisgyermekeknél a végső eszközű folyadékpótlás az úgynevezett intraosszeális úton, a csontvelői érhálózaton át történik. A kereskedelmi forgalomban elérhető, a sürgősségi ellátásban, akár a mentőknél is alkalmazott folyadékbeviteli módszer lényege az, hogy a sípcsontba fúrnak egy lyukat, és ott egy kanülön keresztül folyadékot tudnak bevinni. A sípcsontban bőséges kapilláris hálózat van, az azonnal felveszi, sőt még van egy előnye, hogy az ott képződő vörösvértesteket és a vér egyéb alakos elemeit bemossa a keringésbe, vagyis nemcsak folyadék kerül be, hanem a vérveszteséget is pótolja. Ezt az útvonalat is ki lehetne használni, de a csontvelő esetében még nem tudunk eleget arról, hogy mi történik az mRNS bejuttatása során. Ezt a kutatási irányt fogjuk a közeljövőben kidolgozni a Szegedi Biológiai Kutatóközpontban Zimmermann Zsolt és Erdélyi Miklós közreműködésével.

Prof. Dr. Nógrádi Antal, a Szegedi Tudományegyetem Szent-Györgyi Albert Orvostudományi Kar Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézetének vezetője. Fotó: Kovács-Jerney Ádám

– Tapasztaltak-e mellékhatást az mRNS bejuttatásakor?

– Amikor az mRNS-terápiával kezdtünk foglalkozni, abból indultunk ki, hogy kövessük nyomon egy intakt, ép állatban, hogy az mRNS bejuttatása után keletkeznek-e gyulladási reakciók vagy mellékhatások. Egy eleve gyulladt környezetben ugyanis nehéz monitorozni az újonnan kiváltott gyulladást. Ekkorra már ismertük, hogy maguk az mRNS-t becsomagoló lipid nanorészecske konstrukciók egy nagyon kismértékű gyulladást okozhatnak. Valamekkorát muszáj okozniuk ahhoz, hogy elindítsák a makrofágok odajuttatását, amelyek az mRNS vakcinációt hatékonnyá teszik. A mi esetünkben azt láttuk, hogy a gerincvelőben nincsen mérhető változás. Ez nagyon jó eredmény volt, mert azt jelenti, hogy az egészséges állat immunrendszerét nem bolygatja meg az LNP. Ugyanakkor, hozzá kell tennem, hogy a gerincvelőben más a helyzet, mint a perifériás immunrendszerben; a gerincvelőnek még akár egy kicsiny szúrás után is fennmarad a védett immunológiai állapota, ezt szakmai kifejezéssel privilegizált immunállapotnak nevezzük. Azt jelenti, hogy a központi idegrendszerben a folyamatok immunológiailag másként történnek, mint a perifériás immunrendszerben. Ez egy védelem, egy evolúciós örökség. A központi idegrendszer működését nagyon szigorúan védi egy sor mechanizmus, például a vér-agy-gát vagy az immunológiai barrierek.

– Apropó, evolúció: ha egy őssejt képes „javító” fehérjéket előállítani, akkor a szervezet maga miért nem fejleszt új idegsejteket?

– Hiába igyekszik: nem tud. Az emlősállatok központi idegrendszere fejlődéstanilag lezárt történet. Az idegsejtek osztódása már a kora embrionális korban befejeződik. Amennyi neuron születés előtt rendelkezésre áll, annál nem lesz több, ez egy végleges szám. Ennek okai vannak. Azoknál az állatoknál, amelyek életük során folyamatosan növekednek, például a halak, az idegrendszer is folyamatosan növekszik ezzel együtt. Vannak bennük osztódó idegsejtek az egész élet folyamán, ezért ott a regeneratív lehetőségek is óriásiak. Innen is látszik, hogy nem az idegrendszer képtelen magára a regenerációra, hanem egy csontos, nem növekvő burokban a koponya és a gerincűr bezárt idegrendszeri képleteinek nincs lehetőségük a növekedésre. Ezért a szervezet azzal reagál egy sérülésre, hogy mindent gyorsan rendbe akar tenni, el akar takarítani. Emellett elindulnak ugyan regeneratív folyamatok, de az ellenfékük is be van építve. Fellépnek azok a gátló mechanizmusok, amelyek a túlpörgetett regenerációt nagyon gyorsan lefogják. Azt látjuk ugyanakkor, hogy például korlátozott mértékben IL-10-et a minden kezelés nélkül bejutó falósejtek is termelnek a gerincvelőben. Sőt, a szervezet saját neuronjai is elkezdenek minimális mértékben IL-10-et termelni. Ez a mennyiség azonban elenyésző a terápiás szinthez képest, még egy szuboptimális dózisnak sem tekinthető. A helyzetet inkább csak stabilizálja, de nem oldja meg. Ezért jó az, hogy az őssejtek ebben az esetben tudták, hogy mit kell tenniük, és támpontot adtak nekünk arról, hogy melyek azok a faktorok, amelyek itt segíthetnek.

– Mi lesz a következő lépésük a rágcsálómodellben elért eredmények után? Milyen modellben folytatják?

– Azt gondolom, meg kell néznünk a kezelési rendszert egy nagyobb testű állatban. Kapcsolatot keresünk állatorvosi egyetemekhez kapcsolódó szakmai csoportokkal, akik háziállatok, elsősorban kutyák kezelésében próbálnak innovatív fejlesztéseket végrehajtani. Vannak olyan kutyatípusok, például a tacskók, amelyek az úgynevezett „long vehicle” elv következtében érzékenyek a gerinc mint támasztószerkezet betegségeire, amikor a túl hosszú terhelési ívet nem képes tovább fenntartani a gerinc, és megroppan. A kezelés egyik módja, hogy rögzítik a gerincet mint fizikailag csontos szerkezetet, a másik pedig az, hogy kezelni kell magát az érintett gerincvelőt is. Itt lehetőség nyílik arra, hogy az állattulajdonos beleegyezésével kiváló állatmodellben, egy genetikailag egységes adathalmazban tudjunk dolgozni. Nem is kellene feltétlenül az állatok gerincvelőjéhez nyúlni: az új lehetőségeink megnyitják azt is, hogy akár a hasüregből származó makrofágok IL-10 termelésének a serkentésével tudjuk kezelni őket.

Panek Sándor

A borítóképen: Prof. Dr. Nógrádi Antal, a Szegedi Tudományegyetem Szent-Györgyi Albert Orvostudományi Kar Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézetének vezetője. Fotók: Kovács-Jerney Ádám